Il Growth Promotion Test (GPT) è il passaggio più critico per il controllo qualità dei terreni di coltura in ambito microbiologico nelle produzioni farmaceutiche. Questo articolo spiega perché un GPT corretto necessiti dell’impiego di microrganismi diversi secondo quanto riportato dall’Allegato GMP UE 1 (2022) Sezione 10.9 valutando l’inclusione di isolati ambientali nei programmi GPT, con particolare attenzione al motivo per cui ciò non è opzionale e non limitato alle strutture di grado A. Vengono discussi inoltre, riferimenti normativi, criteri di accettazione da Farmacopea e considerazioni pratiche per l’implementazione nel proprio piano di controllo contaminazioni (CCS).
MICRORGANISMI STANDARD – Il cambio normativo
Il documento revisionato EU GMP Annex 1, pubblicato il 25 agosto 2022 e in vigore dal 25 agosto 2023, contiene un’espansione cruciale delle aspettative GPT. La sezione 10.9, sotto “Controllo Qualità”, ora recita:
“I terreni di coltura impiegati per il monitoraggio ambientale e l’APS (Aseptic Process Simulation) dovrebbero essere testati tramite GPT prima dell’uso, utilizzando un gruppo di microrganismi di riferimento scientificamente giustificato e designato e includendo isolati locali adeguatamente rappresentativi.”
(Tradotto da European Commission, 2022, Section 10.9)
La versione precedente affermava solo che il GPT sui terreni dovessero essere condotto “in conformità con un programma stilato formalmente.” La versione rivista aggiunge due obblighi specifici: la scelta dei microrganismi da testare deve essere scientificamente giustificata e deve includere isolati locali (ambientali) rappresentativi (European Commission, 2022, Section 10.9).
Come scegliere i microrganismi di controllo tra i propri isolati ambientali?
L’Allegato non specifica un elenco definito in quanto ogni ambiente di lavoro può essere soggetto alla rilevazione di microrganismi diversi. La selezione però deve essere “scientificamente giustificata” e “adeguatamente rappresentativa.” Possiamo tradurre queste regole aleatorie considerando come microrganismi da tenere sotto controllo i seguenti:
Organismi che vengono rilevati durante il monitoraggio ambientale di routine. Questi rappresentano la flora comune della struttura e dovrebbero essere recuperabili sui supporti utilizzati per il monitoraggio ambientale.
Organismi recuperati durante indagini sulle deviazioni. Se una specie ha causato una deviazione, è necessario confermare il laboratorio sia in grado di rilevarla, tramite la revisione dei metodi di campionamento e i terreni di coltura per attuare più rapidamente l’azione correttiva.
Organismi difficili da monitorare. Annex 1 afferma che “bisogna prestare particolare attenzione agli organismi recuperati che possono indicare una perdita di controllo, un deterioramento della pulizia o in generale organismi difficili monitorare” (tradotto da European Commission, 2022, Section 9). I batteri e le muffe che formano spore rientrano in questa categoria.
Organismi identificati nelle aree di grado A e B. La revisione Annex 1 richiede l’identificazione degli isolati dalle aree di grado A e B fino al livello di specie (European Commission, 2022, Section 9). Queste specie identificate tramite monitoraggio ambientale dovrebbero essere valutate come candidate per la lista di microrganismi per GPT.
MICRORGANISMI STANDARD – difficoltà nel mantenimento e nel CQ
Includere isolati ambientali in GPT è semplice in linea di principio. Nella pratica, vengono introdotte diverse complessità operative spesso sottovalutate nella formulazione del CCS:
Vitalità del ceppo: è stato osservato che gli isolati ambientali conservati internamente perdono vitalità nel tempo, soprattutto se le condizioni di conservazione (temperatura, concentrazione di crioprotettivi) sono subottimali. La FDA ha segnalato diverse strutture aziendali per non-conformità non giustificate riguardanti escursioni di temperatura nell’immagazzinamento degli organismi di riferimento (GMP Insiders, 2025b).
Controllo dei passaggi: Le farmacopee richiedono che i microrganismi non superino i cinque passaggi rispetto alla coltura di riferimento originale (USP, 2023; Ph. Eur., 2023). Gli isolati ambientali mantenuti tramite ripetute subcolture possono andare incontro a deriva genetica, modificando le loro caratteristiche di crescita e rendendoli poco affidabili come microrganismi standard per il GPT.
Accuratezza dell’enumerazione. Il GPT richiede un’inoculazione ≤100 UFC. La preparazione manuale e l’enumerazione delle sospensioni di isolati ambientali è laboriosa e introduce variabilità (Sutton, 2011). Questo rappresenta una differenza significativa rispetto all’uso di materiali di riferimento commerciali, pre-enumerati e certificati per il numero di UFC per unità.
Rischio di contaminazione crociata. Il mantenimento di più isolati ambientali insieme a ceppi di riferimento compendiali aumenta il rischio di contaminazione crociata all’interno della collezione di colture, compromettendo potenzialmente sia i risultati del GPT sia l’integrità del programma di monitoraggio ambientale (EM).
Conclusione – Raccomandazioni pratiche:
L’integrazione degli isolati ambientali all’interno dei programmi di Growth Promotion Test non rappresenta più una scelta discrezionale, ma un requisito esplicito della revisione 2022 dell’EU GMP Annex 1. L’obbligo di includere ceppi “scientificamente giustificati e adeguatamente rappresentativi” rende essenziale l’utilizzo degli isolati ambientali come parte del GPT, andando oltre i microrganismi compendiali tradizionalmente impiegati e assicurando che i terreni siano realmente idonei a rilevare i contaminanti più probabili della specifica struttura.
La costruzione di un pannello di isolati significativo richiede la valorizzazione dei dati EM storici, con particolare attenzione agli organismi rilevati durante il monitoraggio di routine, a quelli recuperati durante deviazioni e investigazioni, nonché ai microrganismi difficili da monitorare, come formatori di spore e muffe. La presenza di isolati identificati nelle aree critiche di grado A e B – obbligatoriamente caratterizzati a livello di specie – deve costituire una componente centrale del pannello, in quanto tali organismi rappresentano indicatori diretti dello stato di controllo ambientale.
Parallelamente, la gestione interna degli isolati introduce sfide operative significative: la perdita di vitalità nel tempo, la necessità di mantenere un adeguato controllo dei passaggi entro i limiti da Farmacopea, l’elevata variabilità dell’enumerazione manuale e il rischio di contaminazione crociata nella collezione di ceppi. Queste complessità sono state evidenziate anche da osservazioni ispettive, che hanno contestato condizioni di conservazione inadeguate o deviazioni non giustificate nei sistemi di storage dei microrganismi di riferimento. In questo contesto, il ricorso a preparazioni commerciali qualificate può mitigare variabilità, rischi e deviazioni, supportando un approccio più robusto.
La definizione del pannello all’interno della documentazione del CCS – insieme ai criteri di selezione, ai requisiti di revisione periodica e alle regole per aggiungere o rimuovere ceppi – consente di mantenere un processo trasparente, controllato e allineato alle aspettative regolatorie. Una revisione almeno annuale, o in presenza di cambiamenti nella flora della struttura, nei processi produttivi o nelle tendenze EM, è indispensabile per assicurare che il pannello continui a riflettere in modo realistico il rischio microbiologico effettivo.
In definitiva, solo un approccio dinamico, basato su dati reali e pienamente documentato, consente di garantire che il GPT contribuisca in modo credibile alla valutazione dell’idoneità dei terreni e al mantenimento di un Contamination Control Strategy robusto e pienamente aderente alle aspettative regolatorie attuali.
References
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